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      亮菌多糖的提取及純化工藝研究

      文章來源:惠合膠體磨研磨設備廠 發布日期:2015-11-02 14:03:40作者:admin 點擊次數:
      摘 要:用乙醇從亮菌液態發酵產物中提取亮菌多糖,采用活性炭吸附色素,乙酸乙酯脫脂,sevage 法除蛋白,反復醇沉等工藝對亮菌多糖進行純化。使用纖維素柱層析法和紙層析法對純化后的多糖進行純度檢驗,結合紅外光譜掃描和測定硫酸基含量兩種方法對得到的亮菌多糖進行了簡單結構鑒定。結果表明:提取純化后的亮菌多糖基本沒有單糖和寡糖的存在,含量已達到 75%以上,純度較高,具有羥基、羰基、羥酸基、硫酸酯鍵等結構,且硫酸基的含量為 98.32μg/g。
      亮菌(Armillariella tabescens)屬擔子菌亞門,層菌綱,傘菌目口蘑科,假蜜環菌屬,是一種能發光的擔子菌。亮菌是一種兼有食用和藥用價值的名貴食用菌,其主要活性成分為亮菌多糖。多糖是生物體內普遍存在的一大類生物大分子, 除有營養作用之外,還具有的生物活性和藥理特性。亮菌多糖作為一種低毒而免疫活性強、毒副作用少,來源廣的生物大分子,日益受到人們的注意和重視。亮菌多糖是一種性大分子化合物, 常用水提醇沉的模式進行分離提取。在前期實驗中,嘗試通過液體深層發酵工藝培養菌絲體替代固體發酵制備亮菌多糖。本研究主要采用活性炭吸附色素,乙酸乙酯脫脂,sevage 法除蛋白,反復醇沉等工藝對亮菌多糖進行提取純化。 采用纖維素柱對亮菌胞內多糖進行了進一步分離, 并通過紅外掃描、 瓊脂糖凝膠電泳、 硫酸基含量測定對分離純化出的亮菌多糖進行結構分析, 以期對亮菌多糖理化性質的研究提供理論基礎。

      1 材料和方法
      1.1 材料與儀器
      1.1.1 材料
      菌株:亮菌。
      1.1.2 試劑
      1.1.2.1 紙層析試劑
      展開劑:正丁醇∶吡啶∶水=6∶4∶3。
      顯色劑:A:16%硝酸銀水溶液∶丙酮=1∶9。
      B:1% NaOH 乙醇溶液(W/V)。
      C:6mol/L 氫氧化銨。
      1.1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳
      0.5%瓊脂糖溶液。
      緩沖液:0.06mol/L 巴比妥緩沖液(pH=8.6)。
      染色劑:0.1%甲苯胺藍溶液。
      洗脫液:醋酸∶乙醇∶水(0.1∶5∶5)。
      化學試劑使用分析純。
      1.1.3 培養基
      斜面培養基(PDA):馬鈴薯 200.0g,葡萄糖 20.0g,瓊脂 18.0g,蒸餾水 1000mL,自然 pH。
      液體種子培養基:液體 PDA 培養基。
      液體發酵培養基:葡萄糖 50.0g,蛋白陳 4.0g,酵母 膏 1.0g,KH2PO40.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,K2HPO40.1g,維生素 B10.03g,ZnSO40.004g,pH 6.0。
      1.1.4 主要設備儀器
      5804R 型離心機;RE 52-99型旋轉蒸發儀;UV-3802 準雙光束紫外可見分光光度計;Spectzwm one 型傅里葉變換紅外光譜儀。
      1.2 實驗方法
      1.2.1 亮菌多糖的提取
      亮菌進行液體發酵后,收集菌體進行冷凍碾磨,8000r/min 離心 20min,將上清液濃縮至 1/10。添加1/3 體積的 75%的乙醇于上清液中,放置 12h,收集沉淀,離心后于 80℃干燥,得亮菌多糖粉末。
      1.2.2 亮菌多糖的純化
      純化工藝流程:亮菌多糖粉末→活性炭脫色→乙酸乙酯脫脂→savege 法除蛋白→透析去離子→沉淀干燥→纖維素柱層析法分離多糖→紙層析純度檢驗
      脫色:稱取 10g 亮菌多糖粉末,加 250mL 蒸餾水溶解, 再加入 0.8g 活性碳,50℃恒溫條件下不斷攪拌,5h 后 6500r/min 離心 10min,收集上清液。脫脂:在脫色液中加入 5mL 乙酸乙酯,充分混勻后靜置 30min,待明顯分層后收集水層。
      除蛋白:使用 savege 法除蛋白。將 20mL 氯仿∶正丁醇=4∶1(V∶V)混合溶液加入脫脂后的水溶液中,充分振搖后靜置 30min,8000r/min 離心 10min,收集上清液。
      去離子:將上清液裝入透析袋中,在流動的自來水中透析 48h 后,再用蒸餾水透析 24h。
      沉淀干燥:將透析后的溶液加入 1/3 體積的 75%的乙醇,靜置 12h 后離心,收集沉淀。用丙酮和乙醚溶液對沉淀進行連續多次洗滌, 將得到的亮菌多糖沉淀于 80℃干燥,碾磨后得到白色亮菌多糖粉末。
      分離多糖:纖維素層析柱用纖維素填充,柱內纖維素用乙醇預先平衡。將 0.5g 樣品加入少量無水乙醇用碾缽研成粉末,攪拌勻后緩緩加入柱中,自然沉降后, 調節流速使其上下達到 1mL/min。用600mL 乙醇洗脫液進行連續梯度洗脫, 試管收集洗脫液 5mL/每管。用改良的苯酚硫酸法測每管多糖含量,用硫酸鋇比濁法測硫酸基含量。
      紙層析: 用微量注射器吸取一定量樣品溶液點在濾紙上,樣品點的位置距紙的一端 3cm,樣品點彼此間的距離為 2.5cm。樣品量 20μg,點樣體積在 2-20μL 之間。將點好樣的濾紙放入層析缸中上行層析6-8h 后,取出。在層析紙上先噴試劑 A,室溫風干,再將紙浸入試劑 B 中,等斑點顯出后,再浸入試劑 C中以洗去濾紙上的 Ag2O,然后用水沖洗 1h,風干,還原糖顯棕黑色斑點。瓊脂糖凝膠電泳:離瓊脂糖板下端邊緣 1cm 處挖孔,加樣量 5μL(約 10μg 多糖)。用微量進樣器點樣,以葡聚糖作為對照。電壓 150V,電泳 1.5h 后,染色并脫色。
      1.2.3 多糖含量的測定
      采用改良的苯酚-硫酸法。
      1.2.3.1 標準曲線的繪制
      將 50mL 濃硫酸緩緩加入 10mL 水中,冷卻至室溫,加入 0.6g 苯酚晶體,攪拌使其溶解配成顯色液。稱取無水葡萄糖對照品 50.0mg, 定容至25mL,得到濃度為 2mg/mL 的對照品溶液。
      吸取對照品溶液 1mL,2mL,4mL,6mL,8mL,10mL于 25mL 具塞比色管中,加蒸餾水 3.2mL,然后加入顯色劑 6.0mL, 迅速搖勻, 置沸水浴中加熱 30min后,冷水迅速冷卻至室溫。用水作參比,按分光光度法在 490nm 波長處測定吸光度。
      以對照品溶液濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度(A490)為縱坐標繪制標準曲線。葡萄糖對照品標準曲線見圖。求出回歸方程為 Y=1.221x+0.009,相關系數R2=0.9994,說明建立的回歸方程是有意義的。
      1.2.3.2 樣品中多糖含量的測定
      取待測的多糖樣品液 1mL,加入顯色液 6.0mL,迅速搖勻,然后置沸水浴中加熱 30min,冷水迅速冷卻至室溫,用水做參比,按分光光度法在 490nm 波長處測定吸光度。
      1.2.4 硫酸基的測定
      采用硫酸鋇比濁法。
      1.2.4.1 標準曲線的繪制
      準確稱取 105℃干燥至恒重的的無水 K2SO4108.75mg,定容至 100mL 容量瓶中,搖勻,得到濃度為 600μg/mL 的硫酸鹽貯備溶液。
      吸取 0mL,0.04mL,0.08mL,0.12mL,0.16mL,0.20mL 標準硫酸鹽溶液于具塞試管中 , 各管以1mol/L HCL 溶液補加總體積至 0.2mL,加入三氯乙酸 3.8mL 及氯化鋇-明膠溶液 1.0mL, 混合勻,室溫靜置 15min, 用分光光度計在 360nm 處測吸光度A1;以 1.0mL 明膠溶液代替氯化鋇溶液,同法測吸光度 A2;以硫酸基含量(μg)為橫坐標,吸光度(A1-A2)為縱坐標繪制標準曲線。求出回歸方程為 Y=0.0011x+0.0015, 相關系數 R2=0.9995,說明建立的回歸方程是有意義的。
      1.2.4.2 樣品的測定
      稱取純化后的亮菌多糖配制成 1mg/mL 多糖溶液,110℃恒溫 3h 后按照標準曲線制作方法操作,再根據標準曲線得硫酸基含量。

      2 結果與分析
      2.1 亮菌多糖的純化
      亮菌多糖顆粒經脫色脫脂、除蛋白和透析等純化步驟后,再通過纖維素層析后收集洗脫液,用改良的苯酚硫酸法測每管含量,以管號為橫坐標,多糖含量作為縱坐標繪圖。分離純化后的亮菌多糖組分通過纖維素層析柱后分為三個部分,15 管之前為部分,15 到 35 管為第二部分,35 到 55 管為第三部分。、第二部分層析圖中出現部分雜峰,可能是由于上柱樣品中含有少量寡糖, 第三部分可以明顯看出兩個峰, 分析可能是由于得到的亮菌多糖含有兩個不同組分所導致。
      2.2 紙層析結果
      分別將纖維素層析柱所分離出的亮菌多糖的三個部分收集濃縮后, 用微量注射器吸取一定量樣品溶液進行紙層析。部分的點顏色很淡, 第二部分在葡萄糖標準品的位置處出現了較明顯的點, 可能是由于很少單糖和寡糖的存在,而第三部分在紙層析上沒有斑點,說明應該是比較純的多糖,基本沒有單糖和寡糖的存在。通過苯酚硫酸法檢測多糖含量已達到 75%以上。
      2.3 瓊脂糖凝膠電泳結果
      根據紙層析結果,第三部分多糖含量較大,且比較純。將纖維素柱層析后收集的第三部分進行瓊脂糖凝膠電泳?梢钥吹絻蓚明顯的斑點,說明亮菌多糖存在兩個不同的組分,其結果與纖維素層析法分離結果。
      2.4 亮菌多糖的結構分析
      2.4.1 亮菌多糖的紅外光譜掃描
      稱取純化后的亮菌多糖 5mg 用溴化鉀壓片,置傅里葉變換紅外光譜儀 4000-400cm-1中掃描?梢钥闯,在 3400-3600cm-1處有強烈的 O-H 伸縮振動吸收帶;2929cm-1處有強烈的吸收,示有-CH2或 CH3或 C-H 鍵伸縮振動;1653cm-1和 1548cm-1處有 C=O 和 C-N 伸縮振動吸收帶,1420-1320cm-1處有 C-O 伸縮振動和 O-H 彎曲振動偶合產生的兩個吸收帶;1040cm-1處有強的吸收,示有 C-O-C(糖環) 的伸縮振動;1370-1170cm-1處有強烈吸收,示有-O-SO2-R 和-O-SO3-的 S=O 鍵的對稱伸縮和非對稱伸縮振動。 證明純化后得到的亮菌多糖具有羥基、羰基、羥酸基、硫酸酯鍵等結構。
      2.4.2 硫酸基含量測定
      據文獻報道,多糖的抗腫瘤、抗病毒等許多生物活性除與多糖結構、 水溶性和分子量的大小等有關外,與其含有的硫酸基團含量(糖基所帶硫酸基的個數)等也有著直接的關系。通過測定,亮菌多糖中硫酸基的含量為 98.32μg/g。紅外光譜掃描圖結果也可以證明硫酸酯鍵的存在。 這為以后研究亮菌多糖的生物活性提供了理論依據。

      來源:惠合膠體磨研磨設備廠
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